文献速递 | 细胞免疫疗法治疗侵袭性真菌病初探
目前，侵袭性真菌感染是全球卫生领域的重点议题之一。即使经过充分的抗感染治疗，仍有相当部分侵袭性真菌感染患者预后不佳。临床上，烟曲霉所致的侵袭性肺曲霉菌病最为受到关注。众所周知，人体固有免疫细胞包括肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞是参与抗烟曲霉感染的重要免疫防线。同时，经抗原递呈细胞活化的CD4 +和CD8 + T 细胞不仅可发挥直接抗真菌作用，还可促进固有免疫细胞发挥抗菌活性。
既往有研究表明在 IPA 患者中，烟曲霉特异性T细胞的数量与质量与临床结局相关。日前，来自德国维尔茨堡大学的研究团队基于适应性免疫细胞的抗曲霉潜能，设计了一种嵌合抗原受体（CAR），可特异性识别烟曲霉菌丝细胞壁中的保守抗原表位，通过基因修饰手段制备了烟曲霉特异性CAR（Af-CAR）-T细胞，并通过体外细胞学实验、小鼠IPA模型证实了Af-CAR T细胞抗曲霉活性，同时论证了Af-CAR T细胞输注的安全性，为未来细胞免疫疗法应用于侵袭性真菌感染提供了方向。
CAR-T细胞制备
研究人员通过杂交瘤单克隆抗体筛选系统，筛选出了一种可识别烟曲霉菌而不识别其他真菌或细菌的单克隆抗体，并将其编号为AB90-E8。进一步研究发现，该单克隆抗体特异性结合烟曲霉菌菌丝细胞壁，而无法结合烟曲霉孢子。基于该单抗的高度特异性，研究人员利用二代CAR -T设计框架，通过睡美人转座子系统对健康人CD4+和CD8+T细胞进行了基因修饰，构建了相应的Af-CAR T细胞（根据铰链区长度差异设计了Af-CAR-sh和Af-CAR-lo），在后续实验中，以靶向淋巴瘤的SLAMF7-CAR T细胞作为对照。
Af-CAR T细胞体外抗曲霉活性评价
CD4+和CD8+Af-CAR T与烟曲霉菌丝共培养，可在培养体系上清液检测到IFN-γ明显增加，说明上述Af-CAR T可在体外被烟曲霉活化。前述细胞与非烟曲霉菌或烟曲霉孢子共培养，未发现可诱发CAR T细胞高表达IFN-γ，进一步证实Af-CAR T的特异性。
为进一步说明CD4+和CD8+Af-CAR T在体外与烟曲霉菌丝体的相互作用，研究人员利用结构光照明显微成像技术（Structure Illumination Microscopy, SIM）实时原位、展现了上述Af-CAR T细胞对烟曲霉菌丝的特异识别和定位，并发现CD8+ Af-CAR T可与烟曲霉菌丝形成免疫突触，并原位释放穿孔素和颗粒酶B。在经过烟曲霉菌丝刺激后，CD4+和CD8+Af-CAR T均可高表达多种促炎细胞因子如IFN-γ、TNF、GM-CSF以及CCL3趋化因子。通过将CD4+ 和CD8+Af-CAR T 细胞分别和THP-1或人单核细胞来源的巨噬细胞共培养后，巨噬细胞的吞噬功能进一步提升，并呈现更强的促炎表型。
Af-CAR T细胞体内抗曲霉活性评价
为进一步评价Af-CAR T 细胞是否在体内发挥同样的功效，研究人员构建了IPA小鼠模型，并在感染第2天给小鼠注射Ctrl-CAR和CD8+ Af-CAR T 细胞。结果表明，CD8+ Af-CAR T可被募集到肺部，经CD8+ Af-CAR T 细胞治疗的小鼠肺泡灌洗液中趋化因子水平更高，单核细胞比例更多，且肺部病理损伤较对照组明显减轻。经过比对单独输注AB90-E8、CD4+ Af-CAR T和CD8+ Af-CAR T，发现仅CD8+ Af-CAR T输注后可明显改善肺部真菌负荷。因此，研究人员继续在粒细胞缺乏症并发IPA小鼠模型，通过输注CD8+ Af-CAR T，同样证实前述CD8+ Af-CAR T 细胞抗菌活性，明显改善预后。
Af-CAR T细胞安全性评价
最后，研究人员评估了Af-CAR T细胞的脱靶可能。通过组织芯片技术未发现单克隆抗体 AB90-E8可与微阵列中33 种人体组织中的任何一种特异性结合。进一步，研究人员使用烟曲霉菌丝感染健康人肺组织切片，并用载有荧光 Ca 2+ 指示剂 fluo-4 的 CD8 + Af-CAR T 细胞处理。通过动态成像显微镜监测 CD8 + Af-CAR T 细胞内 Ca 2+ 通量以检测 T 细胞活化。添加到烟曲霉感染的肺组织切片中的 Af-CAR T 细胞的 Ca 2+ 通量瞬时急剧增加，而添加到未感染烟曲霉的肺组织切片的 Af-CAR T 细胞中的 Ca 通量反应延迟，进一步证明Af-CAR T细胞仅特异性结合烟曲霉。
专家点评
朱利平 教授
复旦大学附属华山医院感染科主任医师
大家熟知的经典的侵袭性肺曲霉菌病多数发生在免疫低下患者，尤其是各种原因所致的中性粒细胞减少症，而中性粒细胞属于固有免疫系统的重要部分，因此，我们对于T细胞代表的适应性免疫如何发挥抗真菌作用相对缺乏认识。该研究创新性为将癌症治疗领域的CAR-T细胞疗法应用到了真菌感染疾病中，通过临床前动物模型，提出了过继烟曲霉特异性 T 细胞有望改善IPA患者预后，期待未来能有更进一步的临床研究，为治疗难治性侵袭性真菌病提供新的手段！
本文编译
朱榕生
复旦大学附属华山医院
博士研究生