张琪教授团队：首次揭示了Nestin在肝纤维化中的肝星状细胞中生物学功能和表达调控网络
*本文为“第五届感染病与肝病卓越研究年度论坛非感染性肝病分论坛”正式发言，由第一作者陈华欣和通讯作者张琪教授共同撰稿。
中山大学附属第三医院
肝纤维化是病毒性肝炎、酒精性肝病、胆汁淤积性肝病、代谢相关脂肪性肝病等众多慢性肝脏疾病进展的共有过程。早期肝纤维化是肝脏遭受损伤时启动的损伤修复过程，但若肝脏遭受持续或反复损伤，肝纤维化将逐步发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝癌，给社会带来沉重的经济负担。而在肝纤维化发生发展过程中，肝星状细胞的过度激活和扩增是肝纤维化进展的重要驱动因素。当肝脏受到病因刺激时，肝星状细胞由静息态进入激活态，开始迅速增殖，并分泌大量细胞外基质，参与肝脏炎症反应。
肝纤维化概述 Nat Rev Immunol. 2014 Mar;14(3)
中间丝蛋白Nestin是中间丝骨架蛋白家族成员之一。除维持细胞形态外，近年研究发现Nestin具有一系列 “骨架”之外的新功能，包括参与胚胎发育、疾病进展、组织再生等。在肝脏中，Nestin在成体肝脏中表达较低，但会在受到损伤时表达增高。之前的研究发现Nestin在肝癌和胆管癌中表达升高，与不良预后相关。但Nestin在肝脏疾病启动和发展阶段的角色还有待确认。
Nestin在肝脏疾病中的报道 Cell 2014 Jul 31;158(3) ；Cancer Cell 2019 06 10;35(6)
研究检测了Nestin在不同病因的慢性肝病临床标本及小鼠肝纤维化模型中的表达，发现Nestin在纤维化肝脏标本中表达增加，且与纤维化严重程度呈正相关。
当用Nestin与其他肝脏驻留的各类细胞特异性标志物进行免疫荧光共定位时，发现在小鼠肝纤维化模型及肝纤维化患者组织标本中，Nestin与激活的HSC的标志物aSMA存在较多的共定位。当利用Nestin-GFP小鼠，对纤维化过程中的Nestin+细胞进行示踪，流式结果显示Nestin+细胞在肝纤维化造模后明显增高；且大多为Vitamin A+。进一步分选出Nestin+HSC亚群和Nestin-HSC亚群并进行分析发现，Nestin+HSC亚群表达的纤维化marker水平更高，激活程度更强。
纤维化肝脏中上调的Nestin主要分布在激活的肝星状细胞中，
Nestin+肝星状细胞更具有激活表型
在肝纤维化过程中，TGFβ/Smad信号不仅可以促进HSCs的增殖；还可通过调节与细胞外基质生成与降解的基因表达，是HSCs 增殖活化最主要的通路。那TGFβ通路是否直接诱导了Nestin的表达？结果显示，人肝星状细胞系LX2和小鼠原代肝星状细胞在用TGFβ1处理后Nestin的表达显著升高，且利用TGFβ通路抑制剂处理时，肝星状细胞的Nestin表达受到抑制，且TGFβ1不能再诱导Nestin和纤维化marker的表达，这些结果提示Nestin为TGFβ通路下游靶标。同时，分析发现Nestin启动子区域含有多个TGFβ信号通路下游转录因子smad2/3的结合位点。根据分析结果，构建了含不同NESTIN启动子片段驱动的荧光素酶质粒。结果显示，TGFβ通路下游效应分子smad2/3可以结合到NESTIN的启动子区域诱导肝星状细胞中NESTIN表达。
TGFβ通路下游效应分子smad2/3可以结合到NESTIN的启动子区域
诱导肝星状细胞中NESTIN表达
在小鼠原代肝星状细胞和LX2中敲低Nestin后，纤维化激活表型降低，且细胞对TGFβ通路的响应也减弱了。该处提示Nestin与TGFβ通路之间可能存在正反馈通路。实际上，蛋白-蛋白相互作用关系数据库预测提示TβR受体可能与Nestin存在结合。在干扰Nestin后，肝星状细胞的TβR受体mRNA表达量并不受影响，但TβRI受体的蛋白表达量明显下降了，提示TβRI的表达变化是受到转录后调控影响的。进一步试验结果表明，干扰Nestin后，肝星状细胞的TβRI经 蛋白酶体泛素途径降解增多。
干扰Nestin后，肝星状细胞的TβRI经蛋白酶体泛素途径降解增多
根据既往文献报道，Caveolin1（CAV-1）可以介导TβR的内吞并降解，从影响TGFβ通路的信号传导。利用co-ip试验，我们发现，Nestin可以与TβRI结合，且干扰Nestin后，CAV-TBR结合明显增多，TBRI降解增多。当利用免疫荧光进行CAV-1和TβRI染色，动态观察肝星状细胞TBRI受体内吞活动变化，发现在干扰Nestin后，TβRI与CAV-1明显结合增多。当同时干扰肝星状细胞中Nestin和CAV-1表达时 , TGFβ通路活动可得到恢复。因此，干扰Nestin后HSCs激活减弱，TGFβ通路被抑制；干扰Nestin后TβRI通过CAV-1介导的蛋白酶体泛素途径降解增多。
干扰Nestin后HSCs激活减弱， TβRI通过CAV-1介导的蛋白酶体泛素途径降解增多，TGFβ通路被抑制
为了进一步研究Nestin在肝纤维化中的功能，我们选择了AAV6作为靶向纤维化肝脏中肝星状细胞的载体，特异性敲除肝星状细胞中的Nestin，并在小鼠肝纤维化模型中进行了检测。结果显示，与正常造模组相比，AAV6-shNestin治疗组小鼠的肝脏炎症浸润、肝损伤、纤维化均改善了。
在本项研究中，我们首次揭示了Nestin在肝纤维化中的肝星状细胞中生物学功能和表达调控网络，丰富了肝纤维化的发病机制的研究，并为肝纤维化治疗及防治提供了重要的理论依据及研究基础。
模式图 J Hepatol. 2021 May;74(5):1176-1187.
专家点评
中山大学教授/研究员/主任医师，博士生导师，广东省杰出青年基金和“珠江学者”特聘教授获得者，广东省医学领军人才，现任中山大学中山医学院党委书记，中山大学附属第三医院生物治疗中心主任，广东省细胞治疗工程研究中心主任，广东省肝脏疾病研究重点实验室副主任，广东省医学会细胞治疗学分会副主任委员，中华医学会器官移植学分会移植基础学组副组长，中国医师协会器官移植医师分会组织和细胞移植专业委员会副主任委员。
长期从事细胞治疗在肝脏疾病应用的基础与临床研究和肝癌免疫微环境研究，并取得突出成绩。作为课题负责人承担国家自然科学基金6项，省部级科研基金10余项，作为主要申请者参与国家重大研发计划/省部级重大专项课题12项，研究经费逾2000万。作为通讯作者在Journal of Hepatology, Gut, Genome Biology, Molecular Cancer等期刊发表SCI论文50余篇。
我国是肝脏病大国，终末期肝病和原发性肝癌是为我国肝脏移植的主要适应证。若能阻止或延缓慢性肝病向肝硬化、肝衰竭和肝癌的发展，可以从源头上减少对移植肝的需求。针对这一临床难题，我们研究团队历时五年，从基础研究发现到临床组织标本验证，发现中间丝蛋白家族成员Nestin不仅参与细胞骨架形成和细胞形态维持，更是肝纤维化过程中肝星状细胞活化的关键调控分子。但研究过程中，我们也遇到了与临床类似的问题，当在小鼠肝硬化晚期再进行干预治疗时，由于靶向效果不佳，疗效不明显；但这也是我们未来的研究方向，我们将与其他学科进行交叉合作，希望能开发出可高效靶向纤维化肝脏的递送载体，进一步提高抗肝纤维化药物的疗效。