王建设教授团队：Alagille综合征相关NOTCH2变异的致病性判定
复旦大学附属儿科医院儿内科规培医师；专业领域为儿童遗传性肝病，硕士毕业于王建设教授课题组。2022年5月，该课题组在Liver International发表了题为“Defining pathogenicity of NOTCH2 variants for diagnosis of Alagille syndrome type 2 using a large cohort of patients”的研究论文，从频率和致病性软件预测两个方面对ALGS相关NOTCH2变异的致病性判定标准进行了初步定义。
Alagille综合征（Alagille syndrome, ALGS）是由NOTCH2信号通路缺陷引起的一种常染色体显性遗传性肝病，该疾病在1969年由Alagille等首次报道，并在1975年得到进一步阐述。其临床表现复杂多变，可导致肝脏、心脏、脊椎、眼睛、面部和肾脏等多个器官或系统的异常。
有关报道显示，大约97%的ALGS患者是由JAG1突变引起，约1-2%的患者是由NOTCH2突变引起。迄今为止，全球约报道了28例NOTCH2变异相关的ALGS患者，其中多数并不满足ALGS的经典临床诊断标准，并且主要的变异类型为致病性不明确的错义变异。
随着二代测序技术在临床上的广泛应用，大量临床意义不明的NOTCH2变异逐渐被检出。然而，既往较少的病例报道、不典型的临床表现以及致病性不明确的主要变异类型导致NOTCH2变异相关ALGS的诊断存在很大困难。
为了对NOTCH2变异的致病性解读和非典型ALGS患者的临床诊断提供帮助，复旦大学附属儿科医院王建设教授课题组对ALGS相关NOTCH2变异的致病性判定进行了研究。目前，相关研究成果已于2022年5月在Liver International发表。
课题组肝病内部数据库共收录了2016年2月至2019年5月于复旦大学附属儿科医院行基因测序的2087例患者。本研究根据主要的肝功能实验室检查指标（TB、DB、ALT、AST、GGT、TBA）定义了每例患者的肝脏表型。由于ALGS患者的肝脏表型为GGT升高的肝功能异常，所以在本项研究中，课题组基于GGT的高低将2087例患者分为高GGT肝功能异常组和非高GGT肝功能异常组。
首先，课题组根据ALGS的发病率，对肝病内部数据库的患者进行了NOTCH2变异筛选和肝脏表型分析。
以小于0.01%的频率对2087例患者进行NOTCH2变异筛选，共筛选出来自40例患者的35个NOTCH2变异。在40例患者中，16例为高GGT肝功能异常组，24例为非高GGT肝功能异常组；在35个NOTCH2变异中，31个为错义变异，2个为剪切位点变异，2个为无义变异。此外，35个变异中有22个变异未在gnomAD收录，有13个变异已在gnomAD收录。
依次缩小频率范围，将35个NOTCH2变异分为0.01%-0.001%、<0.001%-收录和未收录三组，以分析NOTCH2变异频率和肝脏表型的关系。结果发现，仅在gnomAD未收录变异组中，高GGT患者的比例显著高于非高GGT患者（P=0.041）。因此，研究人员推测：ALGS相关NOTCH2致病变异的频率阈值是否为gnomAD未收录。
基于这个假设，课题组又分析了公共人群数据库中gnomAD已收录的NOTCH2 NMD（无义介导的mRNA降解）变异频率和文献中报道的明确致病的已知变异频率。
文献分析结果显示，目前共报道的20个可能和ALGS相关的NOTCH2变异，有8个是明确致病变异，包括4个引起NMD变异和4个功能学实验验证产生无功能蛋白的错义变异。这8个变异均未在gnomAD收录。而上面提到的gnomAD已收录NMD变异未在病人身上检测到。因此，研究人员推测gnomAD未收录可能是ALGS相关NOTCH2致病变异的频率阈值。
根据频率分析结果，研究组进一步分析了NOTCH2错义变异频率与蛋白功能结构域的相关性。
将来自内部数据库和文献中报道的所有错义变异按照频率分为未收录和收录两组，并标出变异在蛋白上的位置（如下图所示，上面为gnomAD未收录变异，下面为收录变异，变异的不同颜色代表变异在蛋白的位置）。
结果显示，gnomAD未收录组中，位于蛋白重要功能结构域的错义变异比例明显高于gnomAD收录组，这一结果支持了最初的假设。
同样基于频率分析结果，课题组研究了NOTCH2错义变异频率和软件预测性预测的相关性。
将错义变异分为gnomAD收录和未收录两组。在不同的频率组中，选用7种常用的不同预测原理的软件对错义变异的致病性进行预测，从而分析预测致病的软件个数和肝脏表型间有无相关性。
结果显示，在gnomAD未收录组中，当预测致病的软件个数≥3时，高GGT组患者的占比显著高于非高GGT组；而在gnomAD收录组中，预测致病的软件个数和肝脏表型间无相关性。这一结果再次支持了上述的频率假设。
基于以上分析，课题组从频率和致病性软件预测两个方面对ALGS相关NOTCH2变异的致病性进行了初步定义。
可能致病变异：gnomAD未收录，且满足至少三个预测软件预测致病的变异；
可能良性变异：gnomAD已收录变异或gnomAD未收录但少于三个预测软件预测致病的变异。
最后，课题组研究了NOTCH2致病变异与临床表型的相关性。结果显示，可能致病变异组中高GGT患者的比例显著高于可能良性变异组。此外，携带ALGS常见肝外表型的患者比例在可能致病变异组中同样显著高于可能良性变异组。这一结果证明了课题组关于ALGS相关NOTCH2变异的初步致病性判定标准。
当检测到肝脏表型为GGT升高的肝功能异常患者存在NOTCH2变异时，可以从频率和致病性软件预测两个方面对变异进行致病性的初步判断；若变异未在gnomAD收录，且满足至少三个预测软件预测致病时，就应当考虑这个变异的致病性。
专家点评
由于现在分子诊断技术应用越来越频繁，尤其是高通量测序技术的广泛应用。病人检测出来的许多变异的数据无法解释，并且只有部分变异具有临床意义。然而，基于目前的数据库和条件，无法清楚的区分这些变异是否具有临床意义，目前国际上也没有好的指南来对不同疾病的变异进行判断。
因此，结合预测软件，将日常工作经验变成科学的语言，并使其得到统计学的验证，将有助于NOTCH2变异相关ALGS的致病性判定。同时，该文章的发表也有助于其他的学者借鉴，从而进一步完善ALGS的临床诊断标准。但是，利弊同行，该研究也有一定的局限性：功能实验相对缺乏。总之，该研究还有待进一步提高。