结核病领域又一研究成果！MeltPro MTB/PZA技术用于检测耐利福平结核病的吡嗪酰胺耐药性

近日，国家传染病医学中心联合多家结核病分中心在吡嗪酰胺(PZA)耐药研究方面取得重要进展，研究结果提示在PZA耐药率较低的地区，MeltPro MTB/PZA检测可以作为理想的初级筛查工具。相关研究成果以“Ability of the MeltPro MTB/PZA Assay to Detect Susceptibility to Pyrazinamide in Rifampin-Resistant Tuberculosis Patients”（MeltPro MTB/PZA在耐利福平结核病患者中检测吡嗪酰胺耐药性的应用）为题发表在Microbiology Spectrum上。

复旦大学附属静安区中心医院李蓉，国家传染病医学中心/复旦大学附属华山医院李杨、陈昕昶，贵阳市公共卫生救治中心贾立娜，怀化市第一人民医院于红缨为该论文的第一作者。国家传染病医学中心/复旦大学附属华山医院孙峰为通讯作者。

1.研究流程：在2020年6月1日至2021年4月30日期间，基于三个已注册的临床研究(NCT03867136;NCT04717908;NCT05081401)。临床研究是通过快速分子检测确定的耐药结核病优化方案。该研究招募的患者在完成快速检测后能够提供足够的痰液样本。如果患者剩余的痰液量超过0.5ml，则可用MeltPro MTB/PZA进行检测。在临床研究中对所有患者进行基线痰培养，若痰培养阳性，将灭活菌株送NGS进行检测。

此外，所有不一致的结果均采用Sanger测序分析。若NGS测序结果与Sanger测序结果不一致，则以Sanger测序结果为金标准。若Sanger测序结果失败，则以NGS结果作为参考方法。在入组时记录人口统计信息、病史和胸部影像学结果。样本在知情同意下获得，并经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准。

2.MeltPro MTB/PZA检测技术：用LabAid-824S中包含的缓冲液溶解痰液后半小时内，通过自动DNA提取仪提取痰液DNA。然后按照说明书进行MeltPro MTB/PZA检测。该方法采用熔解曲线分析法是一个自动化的过程，在4个通道中有覆盖pncA突变(561 bp)和pncA启动子区域(位置-16~-1)，以确定PZA是否耐药。检测结果可报告为耐药、敏感或不确定等结果。

3. 全基因组测序：NGS作为本研究的金标准，对所有痰培养阳性的菌株进行基因型耐药检测。所有菌落均从培养基中刮取以保持菌株的多样性。采用总核酸提取法(IngeniGen XMK Biotechnologies)提取基因组DNA，采用IngeniGen DNA文库制备法(IngeniGen XMK Biotechnology)构建测序文库。在NovaSeq 6000系统上进行菌株的测序。

利用单核苷酸多态性(SNPs)检测次要亚群，保留所有突变频率超过10%的SNPs。由于NGS的局限性(即无法检测到大片段缺失)，MeltPro MTB/PZA检测和NGS结果不一致的菌株均进行Sanger测序作为最终结果。具有pncA非同义突变或移码突变的菌株经NGS检测结果为PZA耐药。

4.统计学处理：计算该方法检测PZA耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性。当检测结果被归类为"未检测到MTB "、"无效"或"不确定"时，只要有足够的痰液样本，即会重复检测。当第二次检测的结果仍不确定(未检测到MTB、无效或不确定)时，则列出该检测的结果。分类变量比较采用卡方检验，连续变量比较采用独立样本t检验。P＜0.05认为有统计学意义。所有统计检验均使用STATA软件进行。

1.研究人群：在2020年6月1日至2021年4月30日期间，共有239例RR-TB患者入组了临床研究并进行本研究初筛。在排除了19例没有足够痰液的患者后，剩余的220例患者均符合本研究的条件，并进行MeltPro MTB/PZA检测(图1)。参与者的人口统计学特征见表1。大多数患者(201/207,97.1%)痰涂片阳性，175例有肺部空洞。DNA测序发现207例患者中有66例(31.9%)为PZA耐药(图1)。

图1  入组患者的临床和人口学特征

2.MeltPro MTB/PZA检测性能：共有40例患者(18.2%，40/220)没有可解释的MeltPro MTB/PZA结果。其中， 在220例患者中有25例(11.4%)，MeltPro MTB/PZA不能提供判读PZA耐药信息，其中24例报告为“未检测到MTB”，1例结果无效。MeltPro MTB/PZA检测MTB的敏感度为88.2%(95%CI：83.9 ~ 92.4)。此外，15例(6.8%)患者MeltPro MTB/PZA检测结果为PZA耐药不明确。与MeltPro MTB/PZA检测结果可解释的患者相比，无可解释结果的患者出现肺部空洞的比例显著降低(90.0% 和 65.0%， P＜0.01）（表1)。该方法检测的中位时间为4小时(四分位数范围为3.5-4.5)，其中包括标本消化和去污，PCR程序和熔解曲线分析和报告。

表1 入组患者的临床和人口学特征

注  N：数量， MTB：结核分枝杆菌，PZA：吡嗪酰胺，SD：标准差，BMI：身体质量指数， TB：结核

3.MeltPro MTB/PZA法检测PZA耐药的性能：在180例有可解释的MeltPro MTB/PZA检测结果的患者中，有13例培养阴性或原始NGS测序数据不足。因此，167例患者被纳入主要分析。MeltPro MTB/PZA检测PZA耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为91.4% (95%CI：87.1～95.6)、89.9% (95%CI：85.3～94.5)、82.8% (95%CI：77.1～88.5)、95.2% (95%CI：91.9～98.4)和90.4% (95%CI：86.0～94.9)。在有肺部空洞的患者中，研究分析的诊断性能略有改善。MeltPro MTB/PZA检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为94.5% (95%CI：90.9~98.2)、94.7% (95%CI：91.1~98.3)、91.2% (95%CI：86.7~95.8)、96.7%(95%CI：93.9~99.6)和94.6% (95%CI：91.0~98.3)(表2)。

表2  MeltPro MTB/PZA法检测PZA耐药的性能

注 N：数量，TP：真阳性，FP：假阳性，FN：假阴性，TN：真阴性，CI,  PPV：阳性预测值， NPV：阴性预测值，PZA：吡嗪酰胺

4 .MeltPro MTB/PZA与NGS的不一致结果：该方法在58个经NGS测序确认的耐药 中正确检测出53个(91.4%)PZA耐药的情况。对NGS和MeltPro MTB/PZA检测结果不一致的分离株进行Sanger测序。MeltPro MTB/PZA检测中分别有5份和11份样品被误诊为敏感或耐药。

有7株菌株结果为MeltPro MTB/PZA敏感但NGS耐药，其中5株经Sanger测序证实具有与NGS检测相同的突变。Sanger测序确认敏感的另外2个分离株NO.336和R-019, NGS检测的pncA突变率分别为10%和29%，说明分离株存在异质性。

最初，共有14株NGS敏感菌株被MeltPro MTB/PZA误诊为耐药，其中7株经Sanger测序证实为pncA野生型。有4株结果为MeltPro MTB/PZA耐药和NGS敏感的菌株Sanger测序失败，仍以NGS为金标准。在Sanger测序证实的3株耐药菌株中，由于NGS技术的限制，遗漏了超过7bp的缺失或插入，NGS遗漏了P-083(196-206缺失)和No.143(399-408缺失)。在12例培养阴性和1例NGS分析原始数据不足未获得NGS结果的患者。经MeltPro MTB/PZA检测后，4例患者PZA耐药，9例患者PZA易感。

5 .MeltPro MTB/PZA不可解释的结果：第一轮检测结果为耐药不明确的18例，未检出MTB的 33例，无效1例。在19例剩余痰量充足的患者用MeltPro MTB/PZA检测法重新检测，其中13例结果可解释，其余仍不确定。当纳入耐药不明确的结果时，该方法的敏感度和特异度分别为85.5% (95%CI：76.7～94.3)和81.7% (95%CI：74.7～88.6)。

PZA是治疗结核病最常用的短期方案的关键组成部分。因此，有必要对PZA的耐药性进行鉴定。在PZA耐药率较低的地区，MeltPro MTB/PZA检测可以作为理想的初级筛查工具。在耐药结核人群中，它可作为快速和初步确定PZA耐药性的附加检测，而NGS可用于后续验证。