黄玉仙教授团队：HBV-ACLF患者中去泛素化酶CYLD表达低下可增强NF-kB通路激活进而加重肝脏炎症反应

国家传染病医学中心

*本文为“第五届感染病与肝病卓越研究年度论坛青年英才科分论坛2”正式发言，由第一作者张雪云与通讯作者黄玉仙教授共同撰稿。

第一作者张雪云

复旦大学附属华山医院内科学博士，现为复旦大学附属华山医院内科基地规培医生。研究方向主要是慢加急肝衰竭的发病机制、治疗和预后预测。以第一作者或共同第一作者发表SCI5篇。

慢加急肝衰竭（ACLF）是一组以慢性肝病为基础、急性肝内外损伤为诱因、伴有多器官功能衰竭、早期死亡率高为特点的临床综合征[1]。多种病因可导致ACLF，包括酒精、慢性乙型肝炎病毒 (HBV)、慢性丙型肝炎病毒 (HCV)等等。迄今为止，全球有超过 2.5 亿人感染HBV[2]。中国也是HBV感染的高发地区，70％以上的ACLF与HBV感染相关[3]。研究HBV-ACLF致病机制对于制定有效的早期诊断和治疗策略至关重要。而当前大多数研究都集中在ACLF患者外周血免疫细胞的变化上[4-6]。肝脏内的细胞分子机制相关的研究较欠缺。

本研究的目的是通过分析HBV-ACLF、CHB、肝硬化患者及正常对照肝组织转录组测序数据，筛选影响HBV-ACLF发生发展的通路及关键基因，并在临床样本通过qPCR、Western blot、免疫组化等方式进行进一步验证，最后进行细胞功能实验验证，阐明ACLF 发病的潜在细胞分子机制。研究论文已在Emerging microbes & infections期刊正式发表。

RNA测序数据分析

收集HBV-ACLF、CHB、乙肝后肝硬化患者及正常对照肝组织进行RNA测序，层次聚类（图1A）和主成分分析（图1B）均提示HBV-ACLF与其他三组对照区分明显，有独特转录组学特征。HBV-ACLF由CHB和乙肝后肝硬化发展而来。HBV-ACLF与CHB和乙肝后肝硬化相比的共同上调基因以及共同下调基因对研究HBV-ACLF的发病机制有较大意义。我们分别对上调基因（图1C）和下调基因（图1D）进行ClueGo分析，在上调基因中，细胞迁移和趋化占比最高。而下调差异基因大部分与代谢相关。而过度炎症反应是ACLF患者肝脏病理的重要特征，炎症细胞趋化至肝脏是加重炎症的重要原因。

图1 HBV-ACLF、CHB、乙肝后肝硬化患者及正常对照肝组织RNA测序分析

上调基因的GO富集及KEGG富集分析均提示趋化相关通路的激活（图2A,B）。此外大部分趋化因子也是NF-kB下游的靶基因[7]，而KEGG分析中也显示了NF-kB通路的激活。根据趋化相关基因的蛋白质相互作用（PPI）分析（图2C）及趋化因子的表达水平（图2D）筛选出6个关键的趋化因子（CXCL5、CXCL6、CXCL8、CCL2、CCL5和CCL20）。火山图显示这6个趋化因子位于离原点较远的位置（图2E）。

图2 趋化相关基因测序分析

这6个趋化因子包含的靶细胞有T细胞、单核巨噬细胞，中性细胞，NK细胞，Th17细胞（表1）。

表1 CXCL5,CXCL6.CXCL8,CCL2.CCL5和CCL20在HBV-ACLF患者与对照组相比的表达差异及对应靶细胞

临床样本验证趋化因子表达水平及上游NF-kB通路激活

临床样本的qPCR实验提示HBV-ACLF患者肝脏这6个趋化因子mRNA表达水平显著升高（图3）。

图3 HBV-ACLF患者与CHB及正常对照肝组织中CXCL5、CXCL6、CXCL8、CCL2、CCL5和CCL20的表达水平

这6个趋化因子对应的靶细胞T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和NK细胞在HBV-ACLF患者肝脏浸润的数量也显著增高。HBV-ACLF患者肝脏HE染色显示显著的炎症细胞浸润。ACLF-2级患者浸润炎症细胞数量高于ACLF-1级患者（图4）。提示趋化因子在HBV-ACLF发病过程的重要性。

图4 炎症细胞（T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和NK细胞）在HBV-ACLF患者在肝脏浸润数量显著高于对照组

大部分趋化因子和促炎因子都是NF-κB的靶基因，而转录组测序KEGG富集提示NF-κB通路激活（图2B)，我们进一步检测3组患者肝脏NF-κB通路的激活。HBV-ACLF患者肝脏磷酸化P65显著增高，NF-κB通路显著激活(图5)。

图5 NF-κB通路在HBV-ACLF患者肝脏显著激活

既往研究表明，CYLD是NF-kB信号通路的重要负调控因子，此外CYLD还是一种肝脏保护基因，敲除小鼠肝脏CYLD可激活触发门静脉周围肝细胞死亡，肝星状细胞和库普弗细胞活化，促进进行性纤维化、炎症、肿瘤坏死因子 (TNF) 的产生[8-10]。因此我们推测，HBV-ACLF患者中CYLD通过调控NF-KB通路进而调控趋化因子及炎症因子的产生，参与影响HBV-ACLF炎症反应。CYLD在HBV-ACLF患者肝脏和PBMC中表达量均显著下调（图6 A-C）。本文的重点研究趋化和炎症在HBV-ACLF中的作用，巨噬细胞是分泌趋化因子的主要细胞之一，而巨噬细胞在 ACLF 的发病机制中也发挥重要作用，活化的巨噬细胞分泌促炎细胞因子、活性氧和趋化因子，放大促炎信号并增加炎症细胞向肝脏的募集，增强炎症反应[11]。HBV-ACLF 患者肝脏中浸润的固有免疫细胞中巨噬细胞占比最高（图4）。免疫荧光结果示：HBV-ACLF肝脏巨噬细胞CYLD较CHB和NC组下调(图6D)。

图6 CYLD在HBV-ACLF患者及对照组患者肝脏及PBMC中的表达水平

细胞实验验证CYLD通过NF-kB通路影响巨噬细胞趋化功能

我们进一步在单核巨噬细胞系THP-1细胞中验证CYLD对NF-KB通路的激活及趋化因子、炎症因子产生的影响。由于HBV-ACLF患者肠道屏障功能减退，容易发生菌群移位和细菌感染，存在内毒素血症。因此，在敲低CYLD和对照组的巨噬细胞系中，给予LPS刺激，在刺激后48小时内不同时间点收细胞，CYLD敲低组中NF-κB通路激活持续性增强，趋化因子均明显升高，且在48小时内呈现持续性增高（图7）。

图7 LPS作为刺激物时敲低巨噬细胞CYLD显著增强NF-κB通路激活及趋化因子、促炎因子表达

HBV激活是HBV-ACLF患者发病的重要诱因，我们分别给予HBV DNA类似物poly DA:DT和pg RNA类似物poly I:C刺激巨噬细胞，研究CYLD对巨噬细胞的NF-KB及产生趋化因子的影响。在未加刺激的情况下，敲除CYLD可增加NF-KB激活及趋化因子表达，但Poly DA:DT和poly I:C对巨噬细胞NF-κB通路激活及趋化因子表达无显著影响（图8）。说明HBV-ACLF患者巨噬细胞的激活主要与内毒素血症有关，而非HBV激活。

图8 Poly DA:DT和poly I:C刺激巨噬细胞对NF-κB通路激活及趋化因子、促炎因子表达无影响

趋化功能实验显示巨噬细胞敲低CYLD的巨噬细胞对T细胞，单核细胞，中性粒细胞，NK细的趋化能力均显著增强（图9）。

图9 敲低巨噬细胞CYLD对T细胞，单核细胞，中性粒细胞，NK细的趋化能力均显著增强。

利用JSH-23阻断NF-kB通路中 p65核转运可抑制因CYLD敲低巨噬细胞系导致的趋化因子的升高（图10），证明CYLD是通过NF-κB通路调控趋化因子的产生。

图10 阻断巨噬细胞NF-κB通路可抑制因敲低CYLD导致的趋化因子升高

总结

我们通过测序数据分析发现，NF-κB-趋化因子通路激活对HBV-ACLF发生发展发挥重要作用，并进一步探讨潜在机制：HBV-ACLF患者肠道屏障功能减弱导致内毒素血症，激活肝内巨噬细胞NF-ĸB通路。而HBV-ACLF 患者的巨噬细胞CYLD下调发挥不了抑制NF-KB的作用，导致NF-ĸB通路激活的持续性增强，以及趋化因子和促炎因子的持续性高水平分泌。趋化因子吸引淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、NK细胞等大量炎症细胞浸润肝脏，加重肝脏组织损伤。靶向CYLD为将来HBV-ALCF治疗药物的研究提供了新思路。

通讯作者黄玉仙教授

复旦大学附属华山医院感染科主任医师，博士生导师，复旦大学附属上海市公共卫生临床中心兼职教授。长期从事感染病的临床、教学、科研工作。目前任中华医学会病毒学分会临床病毒学组委员，上海市医学会病毒学专科副主任委员，上海市中西医结合学会感染病分会副主任委员，上海市寄生虫协会理事，上海市中西医结合学会肝病专业委员会常务委员，2次获得国家自然基金面上项目资助，先后主持和参与国家、省部级课题15项。主要研究方向是乙肝相关性慢加急肝功能衰竭临床与基础研究，慢性乙肝功能性治愈、无创化肝纤维化诊断及新的预测生物靶标的研究。

参考文献（滑动查看）

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